Práctica 1:
TÉCNICA ASÉPTICA Y TÉCNICAS DE SIEMBRA
INTRODUCCIÓN
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilización es un método de eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos.
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180° C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.
El tipo de microorganismo que será utilizado en este laboratorio serán bacterias. Las bacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composición química o nutricional de los medios es extremadamente variada (Práctica 4: Medios de Cultivo). Los medios más comunes son los caldos (medios líquidos), tubos con agar inclinado y cajas de Petri con agar, también llamadas placas de agar. El agar es una sustancia derivada de un alga marina que se solidifica como un semisólido tipo gelatina. Cuando se añaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden cultivarse en él.
A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. El proceso requiere cuidado y precisión, y se lleva a cabo siguiendo la técnica aséptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el área de trabajo o a la persona que lleva a cabo la transferencia.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilización es un método de eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos.
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180° C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.
El tipo de microorganismo que será utilizado en este laboratorio serán bacterias. Las bacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composición química o nutricional de los medios es extremadamente variada (Práctica 4: Medios de Cultivo). Los medios más comunes son los caldos (medios líquidos), tubos con agar inclinado y cajas de Petri con agar, también llamadas placas de agar. El agar es una sustancia derivada de un alga marina que se solidifica como un semisólido tipo gelatina. Cuando se añaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden cultivarse en él.
A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. El proceso requiere cuidado y precisión, y se lleva a cabo siguiendo la técnica aséptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el área de trabajo o a la persona que lleva a cabo la transferencia.
OBJETIVO
Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización y entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones microbianas en el laboratorio.
Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización y entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones microbianas en el laboratorio.
MATERIAL POR EQUIPO
- 4 caja de agar nutritivo (por equipo)
- Marcador indeleble
- 2 tubos con caldo nutritivo estéril (por equipo)
- 2 tubos con agar nutritivo inclinado estéril (por equipo)
- Gradilla
- Asa de siembra
- Encendedor
- 1 tubo con cultivo en caldo (por grupo)
- 1 tubo con cultivo en agar inclinado (por grupo)
(El material en letras cursivas será proporcionado por el profesor; en rojo está el material que tienen que pedir)
PROCEDIMIENTO
a) Importancia de las condiciones de asepsia.
1. Marcar las cajas de la siguiente manera:
Caja 1: Puntas de los dedos.
Caja 2: Hablar frente a la placa.
Caja 3: Abiertas.
Caja 4: Caja control.
2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos.
Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite tres veces el trabalenguas de “Tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. En tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigo tres tristes tigres.” Tapa de nuevo las cajas.
La caja 3 se dejará destapada durante toda la sesión de laboratorio.
La caja 4 se conservará sin abrir.
Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite tres veces el trabalenguas de “Tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. En tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigo tres tristes tigres.” Tapa de nuevo las cajas.
La caja 3 se dejará destapada durante toda la sesión de laboratorio.
La caja 4 se conservará sin abrir.
3. Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora en posición invertida. La siguiente sesión examina las placas y registra los resultados en la tabla. Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente.
b) Transferencia tubo a tubo.
Cada equipo sembrará 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia como se muestra en la figura 1 (todos los alumnos deberán participar):
• Cultico en caldo-Caldo
• Cultivo en caldo-Agar inclinado
• Cultivo en agar inclinado-Caldo
• Cultivo en agar inclinado-Agar inclinado
Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa de trabajo, ni en la bata. Al acabar la práctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora a 37 °C hasta que te lo indique la profesora.
RESULTADOS
a) Importancia de las condiciones de asepsia.
Realiza la descripción morfológica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas con los distintos tratamiento en relación a la caja control:
- Dibuja las observaciones.
- Reporta el crecimiento de las colonias en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
Registra la morfología macroscópica del microorganismo sembrado en los tubos con agar inclinado y en los caldos de acuerdo a la guía de observación.
DISCUSIÓN
En esta sección se analizarán los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las siguiente preguntas (entre otras): ¿Debes tocar las cajas de agar con tus manos? ¿Puedes encontrar organismos en el aire? ¿Qué resultados soportan tus conclusiones? ¿Cuando trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar? ¿Por qué sí o por qué no?
Contesta las siguientes preguntas relacionadas con la técnica de transferencia:
1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?
2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
3. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado.
4. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
5. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra?
6. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?
GUÍA DE OBSERVACIÓN
Tubos con agar inclinado.
Observa la figura 2, la cual muestra varias formas de crecimiento que se observan en tubos con agar inclinado y compáralas con el tipo de crecimiento que ves en los tubos que sembraste.
Ramificado, Puntiforme, Puntiaguda, Uniforme, Rizoide, Extendido
Figura 2. Tipos de crecimiento en tubos con agar inclinado.
Caldos
A menos que tengas un cultivo fresco de 24 hrs directo de la incubadora, no verás muchos tubos con turbidez. Esto es porque las bacterias tienden a depositarse o a precipitarse cuando se refrigeran por varios días. Después de que te fijes si se formó un anillo o una película en la superficie del tubo (fig. 3), toma los tubos y observa si se presenta el fenómeno de precipitación. Una vez que se completó este paso, mezcla las bacterias agitando, dando golpecitos, rodando el tubo en la palma de tu mano. No agites el tubo de manera que la tapa se contamine con el caldo. Una vez mezclado, puedes observar turbidez, floculación, o una apariencia de hilo dentro del caldo.
Sin crecimiento, Turbio, Floculación, Película, Anillo, Precipitación
Figura 3. Tipos de crecimiento en tubos con caldo.
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