martes, 2 de junio de 2009

Tarea 1

TAREA 1: Técnica aséptica y técnica de siembra

a) Glosario. Define los siguientes términos.

1. Agar
2. Medio de cultivo
3. Caldo de cultivo
4. Incubación
5. Colonia
6. Inoculación
7. Contaminación
8. Técnica aséptica
9. Estéril
10. Desinfección

Nota: Los términos están siempre relacionados con el área de estudio de la microbiología. Antes de copiar un definición, reflexiona si tiene alguna relación con el curso.
Ejemplo común: definición de incubación.

Def. 1. La incubación es el acto por el que los animales ovíparos empollan o incuban los huevos. (definición incorrecta porque no tiene nada que ver con la microbiología)

Def. 2. Período de desarrollo de un cultivo de bacterias. (definición correcta)

b) Haz un diagrama de flujo del procedimiento de transferencia microbiana de tubo a tubo

c) Indica para que sirve el siguiente material; dibuja o esquematiza dicho material.

Mechero de Bunsen
Asa bacteriológica
Pipetas
Micopipetas
Probeta
Matraz Erlenmeyer
Balanza analítica
Potenciómetro
Vortex
Incubadora
Refrigerador
Campana

Bibliografía para el curso

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA PARA EL CURSO

Alexander, S. K., Strete, D. 2001. Microbiology: A Photographic Atlas for the Laboratory. Benjamin Cummings. USA. 193 pp.

Baron, E. J., Finegold, S. M. 1990. Bailey & Scott’s. Diagnostic Microbiology. 8th Ed. The C. V. Mosby Company. USA. 861 pp.

De la Maza, L. M., Pezzlo, M. T., Shigei, J. T., Peterson E. M. 2004. Color Atlas of Medical Bacteriology. ASM press. Washington D.C. 316 pp.

Norrell, S. A., Messley, K. E. 1997. Microbiology Laboratory Manual. Principles and Applications. Prentice Hall. USA. 302 pp.

Wistreich, G. A. 2003. Microbiology Laboratory. Funadamentals and Applications. Prentice Hall. USA. 668 pp.

Lista de material

LISTA DEL MATERIAL NECESARIO PARA EL CURSO

Por grupo:

o 1 rollo de papel aluminio
o 1 jabón antibacterial para manos
o 1 paquete de detergente en polvo
o 1 escobillón
o 1 botella de cloro
o 2 litros de alcohol etílico

Por equipo:

o 50 cajas Petri desechables (plástico) estériles*
o 1 trapo
o 1 rollo de toallas de cocina
o 1 plumón indeleble
o 1 asa microbiológica
o 1 masking
o 1 tijeras
o 1 encendedor
o 1 paquete de algodón

* Disponibles en la farmacia PARIS: República del Salvador No 81, 85, 95-97 Centro Histórico, México D.F.

Costos en pesos (2008, Farmacia Paris)
  • Asa: 6.00 $ c/u
  • Cajas de petri (100 x 15 mm) con 10 cajas: 18.50 $ por paquete
  • Escobillón chico (No. 17): 25.00 $ c/u
  • Escobillon grande (N0. 21): 48.50 $ c/u

Instrucciones generales

INSTRUCCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben realizarse para la seguridad del estudiante y su entorno.

1. No introducir alimentos ni bebidas al laboratorio.

2. Se prohíbe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando se salga por breves momentos.

3. Se debe de recoger el cabello largo para trabajar en el laboratorio.

4. No se admitirán visitas que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.

5. Usar bata blanca bien abotonada.

6. No sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos (a menos que el profesor indique lo contrario).

7. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) debajo de la mesa de trabajo.

8. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan.

9. El orden y limpieza deben persistir todas las prácticas de laboratorio. En consecuencia, al término de cada sesión práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado.

10. Es necesario limpiar la mesa de trabajo antes y después de cada práctica con cloro y alcohol.

11. Cada equipo será responsable de su zona de trabajo y de su material.

12. Antes de utilizar un compuesto químico, se debe revisar su etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de manipulación.

13. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor.

14. No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos.

15. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.

16. Nunca pipetear con la boca.

17. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará a baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.

18. Cuando se manejen productos corrosivos (como ácidos) deberá hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o las ropas. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.

19. Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos; al contrario: ácido sobre el agua.

20. Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.

Evaluación del curso

EVALUACIÓN DEL CURSO DE BIOLOGÍA DE PROCARIONTES

LABORATORIO (50% de la calificación final de la materia)

Calificación final del laboratorio:
Reporte de prácticas 40%
Tarea 30%
Exámenes 20%
Trabajo de laboratorio (asistencia, puntualidad, participación, traer material) 10%

• El día de la práctica los alumnos deberán entregar la tarea (individual) correspondiente a la práctica, si no, no podrán realizar la práctica. Las respuestas deben ser cortas, concisas y con escritura legible. NO OLVIDAR INCLUIR LA BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA (mínimo 2 consultas actualizadas).

• Los reportes de las prácticas (por equipo) se entregarán de una semana a la otra sin excepción. El reporte debe llevar:
o Nombre de los alumnos
o Nombre de la práctica
o Objetivos
o Hipótesis
o Resultados
o Discusión
o Conclusión
o Bibliografía actualizada

• El trabajo durante las sesiones de laboratorio es en equipo (equipos de 4 personas) y los reportes de prácticas se entregarán por equipo. Los cuestionario son individuales. Si hay dos cuestionarios iguales, ambos alumnos tienen cero.
• Cualquier plagio detectado (copiar y pegar páginas Web) implica reprobar el semestre.
• Solamente se aceptan 3 faltas en el semestre.
• Los alumnos deben ser puntuales. Hay 10 minutos de tolerancia; después de este tiempo se tiene un retardo y tres retardos equivalen a una falta.
• El uso de bata durante las sesiones es indispensable.
• Comer sin permiso en el laboratorio implica cero en la práctica.
• Cualquier omisión al reglamento de seguridad repercutirá en la calificación final de laboratorio.

Dudas, comentarios o aclaraciones:
alerv_ciencias@yahoo.com.mx
Laboratorio de Evolución Molecular y Experimental,
Departamento de Ecología Evolutiva,
Instituto de Ecología, UNAM.
Teléfono 56 22 90 06

Práctica 1

Práctica 1:
TÉCNICA ASÉPTICA Y TÉCNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCIÓN

Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilización es un método de eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos.
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180° C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.
El tipo de microorganismo que será utilizado en este laboratorio serán bacterias. Las bacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composición química o nutricional de los medios es extremadamente variada (Práctica 4: Medios de Cultivo). Los medios más comunes son los caldos (medios líquidos), tubos con agar inclinado y cajas de Petri con agar, también llamadas placas de agar. El agar es una sustancia derivada de un alga marina que se solidifica como un semisólido tipo gelatina. Cuando se añaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden cultivarse en él.
A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. El proceso requiere cuidado y precisión, y se lleva a cabo siguiendo la técnica aséptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el área de trabajo o a la persona que lleva a cabo la transferencia.

OBJETIVO

Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización y entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones microbianas en el laboratorio.

MATERIAL POR EQUIPO

- 4 caja de agar nutritivo (por equipo)
- Marcador indeleble
- 2 tubos con caldo nutritivo estéril (por equipo)
- 2 tubos con agar nutritivo inclinado estéril (por equipo)
- Gradilla
- Asa de siembra
- Encendedor
- 1 tubo con cultivo en caldo (por grupo)
- 1 tubo con cultivo en agar inclinado (por grupo)

(El material en letras cursivas será proporcionado por el profesor; en rojo está el material que tienen que pedir)

PROCEDIMIENTO

a) Importancia de las condiciones de asepsia.

1. Marcar las cajas de la siguiente manera:
Caja 1: Puntas de los dedos.
Caja 2: Hablar frente a la placa.
Caja 3: Abiertas.
Caja 4: Caja control.

2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos.
Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite tres veces el trabalenguas de “Tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. En tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigo tres tristes tigres.” Tapa de nuevo las cajas.
La caja 3 se dejará destapada durante toda la sesión de laboratorio.
La caja 4 se conservará sin abrir.

3. Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora en posición invertida. La siguiente sesión examina las placas y registra los resultados en la tabla. Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente.

b) Transferencia tubo a tubo.

Cada equipo sembrará 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia como se muestra en la figura 1 (todos los alumnos deberán participar):
• Cultico en caldo-Caldo
• Cultivo en caldo-Agar inclinado
• Cultivo en agar inclinado-Caldo
• Cultivo en agar inclinado-Agar inclinado
Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa de trabajo, ni en la bata. Al acabar la práctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora a 37 °C hasta que te lo indique la profesora.



RESULTADOS

a) Importancia de las condiciones de asepsia.

Realiza la descripción morfológica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas con los distintos tratamiento en relación a la caja control:

  • Dibuja las observaciones.
  • Reporta el crecimiento de las colonias en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
b) Transferencia tubo a tubo.

Registra la morfología macroscópica del microorganismo sembrado en los tubos con agar inclinado y en los caldos de acuerdo a la guía de observación.

DISCUSIÓN

En esta sección se analizarán los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las siguiente preguntas (entre otras): ¿Debes tocar las cajas de agar con tus manos? ¿Puedes encontrar organismos en el aire? ¿Qué resultados soportan tus conclusiones? ¿Cuando trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar? ¿Por qué sí o por qué no?

Contesta las siguientes preguntas relacionadas con la técnica de transferencia:

1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?
2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
3. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado.
4. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
5. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra?
6. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?

GUÍA DE OBSERVACIÓN

Tubos con agar inclinado.

Observa la figura 2, la cual muestra varias formas de crecimiento que se observan en tubos con agar inclinado y compáralas con el tipo de crecimiento que ves en los tubos que sembraste.


Ramificado, Puntiforme, Puntiaguda, Uniforme, Rizoide, Extendido

Figura 2. Tipos de crecimiento en tubos con agar inclinado.

Caldos

A menos que tengas un cultivo fresco de 24 hrs directo de la incubadora, no verás muchos tubos con turbidez. Esto es porque las bacterias tienden a depositarse o a precipitarse cuando se refrigeran por varios días. Después de que te fijes si se formó un anillo o una película en la superficie del tubo (fig. 3), toma los tubos y observa si se presenta el fenómeno de precipitación. Una vez que se completó este paso, mezcla las bacterias agitando, dando golpecitos, rodando el tubo en la palma de tu mano. No agites el tubo de manera que la tapa se contamine con el caldo. Una vez mezclado, puedes observar turbidez, floculación, o una apariencia de hilo dentro del caldo.


Sin crecimiento, Turbio, Floculación, Película, Anillo, Precipitación

Figura 3. Tipos de crecimiento en tubos con caldo.

miércoles, 6 de mayo de 2009

Un oasis de diversidad microbiana

CUATRO CIÉNEGAS, COAHUILA

Cuatro Ciénegas es una de las Áreas Naturales Protegidas más extraordinarias de México. Esto se debe en parte a la diversidad de hábitats acuáticos que se encuentran a la mitad del desiero Chihuahuense. Este oasis sustenta un gran número de especies (animales, plantas, microorganismos), muchas de las cuáles son edémicas del lugar.

En Cuatro Ciénegas existen numerosas especies bacterianas de gran interés científico. Desde el punto de vista comunitario, las cianobacterias del valle son de gran interés porque forman estromatolitos (estructuras órganosedimentarias laminadas principalmente de carbonato de calcio adheridas al sustrato, producto de la actividad metabóbilca de microorganismos que al acidificar el medio precipitan el calcio). Los tapetes microbianos son igualmente interesantes porque en ellos están representados molecular y funcionalmente los ciclos biogeoquímicos que sustentan la vida. Desde un punto de vista evolutivo, las características de los hábitat acuáticos (limitación de fósforo, aislamiento geográfico de las pozas, marcada heterogeneidad espacial y temporal) nos brindan la oportunidad de estudiar numerosos procesos evolutivos en bacterias, como su adaptación a la condiciones ambientales del lugar (Souza et al., 2006)


Descripción del sitio

El valle de Cuatro Ciénegas de aproximadamente 150,000 hectáreas, está rodeado por montañas que se elevan hasta 3000 metros sobre el nivel del mar.

El clima de la región es árido. Las temperaturas son extremas, excediendo 44 °C en el verano y bajando a 0 °C durante el invierno. La precipitación promedio anual es menor a 200 mm (Minckley, 1969). Pocas veces al año llueve - entre mayo y octubre - aunque las escasas lluvias suelen ser torrenciales.

A pesar de la baja precipitación, en el valle abunda el agua subterránea que emerge a la superficie, formando pozas, ríos y lagunas dónde habita una gran variedad de organismos acuáticos.

Las aguas subterráneas tienen una alta concentración en sales de sulfato - domina el sulfato de calcio mientras que cloruro de sodio está en bajas concentraciones - pero son extremadamente oligotróficas (concentraciones de PO4 menores a 1 μmol) (Elser et al., 2005).

Los hábitats acuáticos del valle soportan una gran variedad de especies endémicas (Contretas-Balderas & Lozano-Vilano, 1996, Contreras-Aquieta, 1998). Los estromatolitos, que son considerados globalmente raros, crecen en varias de las pozas y ríos. Debido al elevado número de endemismos, el gobierno federal declaró en 1984 a Cuatro Ciénegas Coahuila como Área Natural Protegida en la categoría de Zona de protección de Flora y Fauna y fue recategorizada en el 2007 a Área de Protección de Recursos Naturales.




Cuatro Ciénegas, Coahuila, México.


Microbiolitos.

Referencias:

Contreras-Aquieta, A. 1998. New records of the snail Melanoides tuberculata (Müller, 1774) (Gastropoda: Thiaridae) in the Cuatro Ciénegas basis, and its distribution in the state of Coahuila, México. The Southwestern Naturalist. 43: 283-286.

Contreras-Balderas, S. & M. L. Lozano-Vilano. 1996. Extinction of the most Sandia and Potosí valleys (Nuevo León, México) endemic pupfiches crayfishes and snail. Ichthyological exploration of freshwaters. 7: 33-44.

Elser, J. J., J. H. Schambel, M. Kyle, J. Watts, E. W. Carson, T. E. Dowling, C. Tang & P. D. Roopnarine. 2005. Response of grazing snails to phosphorus enrichment of modern stromatolitic microbial communities. Freshwater Biology 50: 1808-1825.

Minckley W. L. 1969. Environments of the Bolsón of Cuatro Ciénegas, Coahuila, México. Texas Western Press, Science Series, N 2, 65 pp.